ACTUALITES :

CYTOGÉNÉTIQUE DES GAMETES ET DE L’EMBRYON HUMAIN

Contribution des Anomalies Chromosomiques en Pathologie de la Reproduction

Docteur Fouad Bayane

I / Introduction

Dans l’espèce humaine les aberrations chromosomiques représentent la cause la plus importante de pertes fœtale (Chard et al., 1991) elles sont responsables de la moitié des avortements spontanés survenus au-delà de la huitième semaine de grossesse. En effet 5% des mort-nés ont un caryotype anormal et 0.5% des nouveaux nés sont porteurs d’aberrations chromosomiques (jacobs PA 1990).

Pour comprendre les faits pathologiques il est nécessaire d’étudier le génome des gamètes et des embryons afin de mieux définir la contribution pré et post-zygotique à la genèse des aberrations chromosomiques.

L’étude du sperme humain a été entreprise il y a quelques années dans l’espoir d’expliquer certains phénomènes biologiques conduisant aux avortements spontanés, aux retards du développement, aux malformations ou à l’infertilité masculine. Grâce à la cytogénétique il a été alors possible de mettre en évidence le rôle important des aberrations chromosomiques dans divers types d’échecs de la reproduction rencontrés en pratique médicale (Martin et al., 2003).

Généralement après stimulation hormonale et une ponction ovarienne, en moyenne, 30% des ovocytes ne se clivent pas 48 heures post- insémination. Ces œufs constituent un matériel de choix pour les études cytogénétique du gamète femelle (Benkhalifa et al., 2003).

Les embryons humains obtenus après une FIV présentent 30% à 50% d’anomalies chromosomiques essentiellement, l’aneuploïdie, le mosaïcisme et la polyploïdie (Munne et al., 2002).

         La culture d’embryons et la cytogénétique ont permis l’estimation de la mixoploïdie au stade pré-implantatoire à 30-40% ( Clouston et al 2002). L’application de la F.I.S.H.  aux embryons bloqués, aux embryons avec un retard de segmentation ou fragmentés et aux embryons normaux a permis la détection de plusieurs aberrations chromosomiques  (Aneuploïdie, Polyploïdie, mosaïcisme). Grâce à l’application des techniques de cytogénétiques et de biologie moléculaire (FISH multicouleurs, PCR fluorescente et quantitative) sur cellule unique, il est aujourd’hui possible d’analyser le statut chromosomique des gamètes et de l’embryon afin de comprendre la contribution des anomalies chromosomiques en pathologie de la reproduction.

II / ORIGINES DES ANOMALIES CHROMOSOMIQUES

A- quelques notions sur les chromosomes mitotiques et méiotiques

Le caryotype humain normal est formé de 46 chromosomes comprenant 22 paires d’autosomes et deux chromosomes sexuels : les gonosomes X et Y conformément à la nomenclature ils sont numérotés de 1 à 23 selon leur taille et la position du centromère : médiane (chromosome métacentrique), plus proche d’une extrémité (chromosome télocentrique), subterminal (chromosome acrocentrique).

La bonne identification de chaque paire chromosomique et la localisation des anomalies de structure sont possibles grâce aux techniques de marquage en bandes à haute résolution, à l’hybridation in situ par sonde chromosomique spécifique (H.I.S), à l’hybridation comparative génomique (C.G.H) et à l’hybridation du profil génomique sur puce d’acide nucléique ( Harper et al 1999).

Méiose et fécondation

 Les divisions méiotiques et la formation du patrimoine  génétique de l’œuf fécondé sont les évènements essentiels survenant au cours de la maturation des gamètes et de la fécondation.

On sait que la méiose comporte deux divisions successives. Elles permettent à partir de cellules germinales primordiales diploïdes (46 chromosomes) la formation de gamètes haploïdes (23 chromosomes) ainsi, que la  possibilité de redistribution des gènes par crossing-over.

Avant d’entrer en première division méiotique, le gonocyte duplique ses chromosomes; chacun d’entre eux est alors formé de deux chromatides (bivalent).

Sur le plan génétique, la première division méiotique a les conséquences les plus importantes. Elle est en effet réductionnelle et comprend cinq stades :

- leptotène (individualisation des chromosomes en filaments)

- zygotène (appariement des chromosomes paternels et maternels d’une même paire : chez l’homme, les chromosomes X et Y  sont contenus dans la vésicule sexuelle),

- pachytène (individualisation des chromosomes homologues appariés formant des tétravalents composés de quatre chromatides).

- diplotène (à ce stade, les chromosomes se séparent mais il y a persistance des chiasmas qui traduisent les échanges entre chromatides (crossing-over),

- diacinèse et métaphase I : ces stades sont suivis de l’anaphase et de la télophase qui aboutissent à deux cellules dotées chacune d’un lot haploïde avec un exemplaire de chaque chromosome sous forme de bivalents recombinants.

Grâce aux échanges de chromatides survenus  au cours du crossing-over le nombre de recombinaisons possible est pratiquement infini.

Lors de la deuxième division, il n’existe pas de synthèse préalable d’ADN. Le mécanisme est semblable à celui d’une mitose somatique. Il en résulte deux cellules filles comportant chacune un lot haploïde de chromosomes.

La chronologie et les conséquences de ces deux divisions sont différentes en fonction du sexe.

Chez l’homme, la gamétogenèse commence à la puberté et est un processus continu. Le cycle spermatogénétique entre la spermatogonie A  et l’émission du spermatozoïde dure environ 74 jours.

Chez la femme, la gamétogenèse est un processus discontinu; les ovogonies se multiplient au début de la vie fœtale et l’ovogenèse commence dès que la gonade est différenciée en ovaire (3ème mois fœtal).

Les ovocytes I entrent en prophase de première division et restent bloqués à un stade «dictyotène » ou post- diplotène (propre au sexe féminin), et ceci jusqu’au début des ovulations qui surviennent entre la puberté et la ménopause.

Le pic de LH provoquant l’ovulation permet la reprise de la première division qui s’achève avec l’expulsion du premier globule polaire. L’ovocyte entre directement en division et reste bloqué en métaphase jusqu’à la fécondation. La fin de cette deuxième division va être déclenchée par l’activation de l’ovocyte par le spermatozoïde qui induit l’anaphase et la télophase, et  donc la formation du deuxième globule polaire.

Après la fécondation, une enveloppe nucléaire se forme autour des chromosomes des gamètes mâles et femelles. Ainsi apparaissent les pronuclei qui fusionnement après quelques heures pour donner naissance au noyau diploïde du zygote. Ce dernier entre aussitôt en division.

B- les aneuploïdies chromosomiques

L' aneuploïdie est caractérisée par le gain ou la perte d’un ou plusieurs chromosomes. Ainsi le nombre de chromosomes caractéristique d’une espèce se trouve modifié (2n+1, 2n+2, etc.…). Les individus possédant des chromosomes supplémentaires sont dits hyperploïdes et ceux ayant perdu des chromosomes sont dits hypoploïdes.

Les principales aneuploïdies sont :

- les monosomies et les nullosomies, caractérisées par l’absence d’un chromosome ou d’une paire de chromosomes homologues,

- les trisomies et les tétrasomies, caractérisées par la présence d’un chromosome ou d’une paire de chromosomes homologues surnuméraires.

Mécanismes cytologiques d’apparition des aneuploïdies.

La présence d’aneuploïdie peut être la conséquence d’une méiose anormale. Les associations de types multivalents en métaphase I, les disjonctions non équilibrées de chromosomes en anaphase, la présence de chromosomes retardataires ou situés en dehors de la plaque métaphasique, etc..., sont les principales anomalies méiotiques qui sont à l’origine de gamètes anormaux et d’embryons aneuploïdes.

L’aneuploïdie peut être provoquée par la non-disjonction méiotique, processus au cours du quel les chromosomes homologues d’une ou plusieurs paires chromosomiques ne se séparent pas durant l’anaphase et migrent ensemble vers un pôle, ce qui aboutit à la formation de gamètes aneuploïdes non équilibrés génétiquement.

En 1959, il a été mis en évidence la non disjonction des autosomes humains de la paire 21 à l’origine du syndrome de Down. Le syndrome de klinefelter (47, XXY) et le syndrome de Turner (45, X) sont provoqués par la non disjonction des gonosomes.

Une troisième voie d’apparition d’aneuploïdies naturelles est représentée par les mutations asynaptiques et désynaptiques. Dans le premier cas, il n’y a pas appariement entre les chromosomes homologues à la prophase I.

Par contre le deuxième cas, l’appariement est réalisé seulement pour certains chromosomes. En conséquence tout ou une partie des chromosomes demeurent sous forme d’univalents. La disjonction anaphasique n’était pas équilibrée, les gamètes sont aneuploïdes dans ce cas.

Les individus hyperploïdes ont une fertilité importante que les hypoploïdes. D’une manière générale les sujets aneuploïdes ont toujours une vitalité plus réduite et présentent une fertilité plus réduite que les sujets euploïdes.

 

C- Anomalies de structure

Les anomalies chromosomiques de structure sont la conséquence de cassures chromosomiques suivies de réarrangements. Les études des anomalies structurales se sont principalement concentrées sur les translocations et les inversions. D’autres anomalies de structure ont été décrites : tel que les chromosomes GAP (présentant des lacunes), délétions terminales ou interstitielles, duplications partielles, iso chromosomes, cassure d’une chromatide suivie d’échange.

Ces anomalies peuvent affecter un ou plusieurs chromosomes homologues  et peuvent être équilibrées ou non. Les anomalies équilibrées n’entraînent pas de modification quantitative du matériel chromosomique. Elles n’ont habituellement aucune incidence pathologique. Les conséquences de modification de position des gènes doivent toutefois être étudiées.

Les anomalies de structure peuvent apparaître de novo : les deux parents ont alors un caryotype normal. L’accident survient au cours de la gamétogenèse paternelle ou maternelle. Environ la moitié des anomalies de structure sont transmises à la descendance (BOUE A, 1984).

Les aberrations de structure les plus fréquentes sont :

a-      les délétions : Perte d’un fragment chromosomique qui aboutit à une monosomie partielle concernant les gènes présents sur ce fragment.

b-      les duplications : La duplication d’un fragment de chromosome aboutit à une trisomie partielle.

c-      Les inversions : Elles sont para ou surtout péricentriques. Il n’y a pas de perte de matériel génétique mais la séquence des gènes est inversée. Il existe deux points de cassure sur le même chromosome, suivies de recollement après inversion du segment intermédiaire. On parle d’inversion péricentrique si le centromère est concerné et paracentrique si les deux cassures ont lieu sur le même bras. Bien qu’elle constitue un remaniement apparemment équilibré, l’inversion peut entraîner chez l’homme des troubles de la reproduction (oligospermie plus ou moins sévère).

Il semble que les inversions puissent produire des compléments non équilibrés si les chromosomes s’apparient en une boucle d’inversion comportant un nombre impair de crossing-over.

d-     les translocations réciproques : à la suite de deux cassures chromosomiques survenant sur des chromosomes différents, il se produit un échange de fragments aboutissant à deux recombinants. S’il n’y a pas eu perte de matériel au niveau des cassures, le capital génétique reste intact avec une répartition modifiée. Le sujet garde 46 chromosomes (23 dans les gamètes). Le caryotype est dit transloqué équilibré.

A l’état équilibré ; les anomalies de structure telles que les translocations et les inversions sont sans conséquence pour les sujets porteurs. Ces anomalies peuvent se transmettre sous forme déséquilibrée lors de la gamétogenèse. Les descendants peuvent donc avoir un caryotype déséquilibré.

e-      les translocations robertsoniennes : des restructurations chromosomiques de type robertsonien entraînent des anomalies numériques des chromosomes. Ce mécanisme a été observé par R. ROBERTSON en 1916. Des cassures et des fusions chromosomiques ont lieu sans variation de la quantité du matériel génétique. Pour confirmer une translocation robertsonienne, on doit démontrer que la quantité d’ADN n’a pas varié et que la nombre fondamental (NF) des bras chromosomique est constant.

* En cas de fusion centrique, deux chromosomes acrocentriques s’associent en un seul chromosome méta, subméta ou subtélocentrique et pourvu de deux bras longs. Ce phénomène est accompagné de la formation d’un petit fragment qui sera perdu ultérieurement. Les fusions centriques sont parmi les restructurations chromosomiques les plus communément observées en cytogénétique végétale et animale.

* En cas de fission centrique, les deux bras du chromosome se séparent. Il y a augmentation totale du nombre des chromosomes mais le nombre fondamental (NF) et la quantité d’ADN restent constants. Il est difficile d’expliquer l’apparition d’un centromère supplémentaire. Pour la réalisation de ce genre de fission un petit chromosome surnuméraire apporterait le centromère supplémentaire. Cette fission centrique est plutôt une translocation réciproque entre le petit chromosome surnuméraire et le chromosome métacentrique.

En général, les fissions centriques sont plus rares que les fusions. Ces deux types de restructuration peuvent coexister et sont à l’origine d’une variation du nombre chromosomique de type pseudo-aneuploïde.

La majorité des translocations robertsoniennes intervient entre les chromosomes 13 et 14. Les porteurs ont un risque plus élevé de descendance anormale que ceux atteints de translocation impliquant le chromosome 21

Les études effectuées chez les mort-nés ou au cours de la période prénatale ne permettent pas d’analyser correctement la ségrégation méiotique. D’autre part les embryons chromosomiquement non équilibrés ont en général une survie très limitée. Il est plus facile d’étudier la ségrégation méiotique dans les gamètes humains.

Les premières données sur l’analyse chromosomique du sperme d’un porteur d’une translocation robertsonienne t(14 ;21) ont été publiées par Balkan et Martin (1983). Depuis d’autres études ont montré la fréquence des translocations robertsoniennes dans les avortements spontanés.

III- ANOMALIES CHROMOSOMIQUES DANS LE SPERME HUMAIN

Les informations concernant la fréquence, le type et la cause des aberrations chromosomiques du spermatozoïde provenaient antérieurement d’études indirectes portant sur les produits d’avortement et sur le nouveau-né.

La plupart des aberrations survenant au cours des premiers stades du développement restaient pratiquement inconnues. L’analyse directe des chromosomes du spermatozoïde a donc fourni les premières informations fiables concernant les anomalies cytogénétiques du gamète mâle.

La majorité des études a porté dans un premier temps sur des sujets normaux (Martin et al. 1982, Sele et al, 1989, Alver et al 2000, Devillard et al 2002). L’effet de l’âge du donneur sur la fréquence des anomalies chromosomiques a été évalué (Martin et al 2003). Des techniques de présélection du sexe du sperme (Bechet et al, 1989) et l’étude des effets de la micro-injection de sperme humain dans des ovocytes de hamster (Martin et al.,1988) ont également été réalisées.

Des investigations ont porté sur des sujets présentant un risque élevé d’anomalies chromosomiques gamètiques tels que des hommes exposés à une radiothérapie (Miharo et al 1999, Rosenbuch et al 2000) ou porteurs de réarrangements chromosomiques constitutionnels tels que les translocations et les inversions (Escudero et al 2000, Shi et al 2001)

                    

           A- Le caryotype des spermatozoïdes des sujets normaux par la technique Homme-Hamster

Le spermatozoïde humain est une cellule hautement différenciée. A l'issue de la spermatogenèse, le noyau du spermatozoïde présente une chromatine extrêmement condensée. La décondensation de la chromatine n'intervient que si le spermatozoïde est impliqué dans une fécondation. Compte tenu de cette particularité, l'analyse chromosomique directe des gamètes mâles est impossible par le biais des techniques cytogénétiques conventionnelles. L'analyse cytogénétique des spermatozoïdes humains a été rendue possible grâce au développement d'un modèle unique de fécondation in vitro hétérospécifique homme-hamster

(

A : Visualisation des chromosomes de spermatozoïdes humains après fécondation hétérospécifique in vitro
(Test Hamster).

Navarro et al., (1990) ont répertorié 4% d’anomalies numériques et 6.9% d’anomalies structurales à partir de 503 échantillons de sperme. Brandriff et al .,(1985) ont observé sur 11 donneurs une fréquence moyenne de 7.7% d’anomalies structurales (de 2 à 16%).

Martin (1991) a analysé un total de 5629 compléments  chromosomiques provenant de 83 hommes normaux. La fréquence moyenne des anomalies dans cette population est de 13.6%. Le taux d’anomalies structurales dans cette étude est de 9.4% et celui des anomalies numériques est de 4.2%. On observe 0.6% d’hyper haploïdies, 3.5% d’hypohaploïdies  et 0.1% d’ aneuploïdies multiples.

Martin (1991) a rapporté chez 83 sujets une fréquence moyenne de 9.4% (0 à 22%). La fréquence des anomalies de structure semble spécifique pour chaque donneur (Brandriff et al., 1995). Elle peut être liée à des différences génétiques , à l’âge (Martin et al 2002) ou à l’exposition éventuelle à des agents mutagènes .

Une comparaison des fréquences moyennes des compléments hyper haploïdes démontre une convergence des données de la littérature. Dans une étude française, 450 caryotypes provenant de 5 hommes normaux ont été analysés ; le taux d’anomalies chromosomiques observé est de 12.2% avec 5.24%  d’aneuploïdie et 6.96% d’aberrations structurales. Un excès de compléments hypohaploïdes semble indiquer qu’a côté des non disjonctions méiotiques d’autres mécanismes peuvent intervenir tels que l’anaphase lag ou des pertes artéfactuelles de chromosomes survenant pendant la préparation des lames. On sait que la technique de TARKOWSKI (1966) peut entraîner un excès significatif d’hypo haploïdies (Benkhalifa et al 1994).

Une estimation de l’aneuploïdie peut être obtenue en doublant la fréquence des hyper haploïdies et des aneuploïdies multiples. On obtient une fréquence corrigée de 1.4 %. En utilisant cette estimation, la moyenne totale des anomalies chromosomiques du sperme s’établit à 10-15 %.

L’ensemble des études précédentes montre que la fréquence globale des anomalies chromosomiques dans les spermatozoïdes de sujets normaux se situe aux environs de 10- 15% (kalontri et al 2003).

B- Distribution des aneuploïdies

La distribution et la fréquence des aneuploïdies en fonction du chromosome concerné sont étudiées afin de déterminer si certains chromosomes sont particulièrement susceptibles  de non disjonction.

Si tous les groupes de chromosomes s’avèrent présenter la même fréquence d’aneuploïdies, un mécanisme unique de non disjonction pourrait être en cause. Dans le cas contraire des mécanismes particuliers sont à rechercher. Les caractéristiques particulières des chromosomes doivent être examinées afin de déterminer les facteurs qui influencent le pourcentage de non disjonction.

Martin et al.,(2002) ont réalisé une étude portant sur 15000 compléments chromosomiques d’hommes normaux et 5652 compléments d’hommes porteurs d’anomalies chromosomiques constitutionnelles , ceci en tenant compte exclusivement des compléments hyper haploïdes. Les données ont été analysées séparément puis mises en commun après une analyse statistique qui ne démontre aucune différence entre les deux groupes.

Il a été supposé pour l’analyse statistique que tous les chromosomes avaient une probabilité égale de non disjonction et deux tests de binômes, utilisant les probabilités exactes ont été réalisés (Pellestor et al 1994) afin de déterminer si chaque chromosome (ou groupe de chromosomes) présentait une fréquence d’hyper haploïdie différente d’une manière significative de la fréquence attendue. Tous les groupes de chromosomes sont représentés en cas d’hyper haploïdie. Ceci démontre que tous les groupes sont susceptibles de non disjonction.

Une fréquence significative d’hyper haploïdie est observée pour le 1, le 21 et les gonosomes. La fréquence d’hyper haploïdie du chromosome 1 est surprenante car la trisomie 1 est rarement présente dans les avortements spontanés. Elle a toutefois été observée dans huit cellules d’un pré-embryon humain (WATT et al. 1987). Il est possible que la trisomie 1 soit présente dans les produits de conception mais disparaisse à la période pré-implantatoire. Le taux élevé de trisomie 9 observé dans une autre  étude par HIS reste à confirmer.

La fréquence élevée d’hyper haploïdie  pour le 21 et les gonosomes confirme les informations obtenues dans les avortements spontanés et chez les nouveau-nés.

Plusieurs études ont d’autre part démonté que la contribution paternelle à la trisomie 21 est proche des 20%, tandis que les trisomie pour d’autres autosomes ont une origine paternelle  beaucoup plus rare (Hassold et al 2000).

Une augmentation significative de la fréquence de hyper haploïdie des gonosomes a été observée dans la méiose I du sperme humain. Les chromosomes X et Y, fréquemment associés sous forme de vésicule sexuelle, sont prédisposés à la non-disjonction.

Comme on le sait, il existe quatre aneuploïdies communes des chromosomes sexuels humains : 45, X ; 47, XYY ; 47, XXY et 47, XXX. Il a été démontré que la majorité de celles-ci sont d’origine paternelle. Une origine maternelle a par contre été démontrée pour les aneuploïdies des autosomes (Jacobs et al, 1988).

C- Les sujets porteurs d’anomalies Constitutionnelles.

Les hommes porteurs d’une anomalie chromosomique constitutionnelle présentent un risque de descendance anomale sur le plan cytogénétique. Des avortements spontanés surviennent fréquemment chez les conjointes de ces patients. L’établissement du caryotype des spermatozoïdes a permis pour la première fois une analyse détaillée de la ségrégation des chromosomes d’hommes porteurs d’un réarrangement chromosomique, (translocations ou inversions).

Dans la littérature plus de 100 différents translocations réciproques ont été étudiées pour préciser le mode de ségrégation. Tous les types de ségrégation théoriquement définis ont été observés. On sait que certains d’entre eux sont rarement présents chez le nouveau-né et dans les avortements spontanés. Ils peuvent être éliminés pendant la période embryonnaire.

La fréquence des compléments déséquilibrés varie de 19 à 77% pour les translocations réciproques et de 8 à 27% pour les translocations robertsoniennes.

Cette donnée est intéressante car les hommes et les femmes porteurs d’une translocation réciproque ont un risque équivalent d’avoir une progéniture chromosomiquement anormale, tandis que les hommes porteurs d’une translocation robertsonienne ont un risque plus faible d’avoir un enfant à caryotype déséquilibré (Escudero et al 2001).

L’appariement chromosomique pourrait être plus facile pendant la méiose mâle en cas de translocation robertsonienne et aboutira à des gamètes à complément chromosomique normal ou équilibré. Les individus porteurs d’une anomalie chromosomique peuvent également avoir une descendance aneuploïde par suite d’un effet inter chromosomique (Aurias , 1978).

La présence de chromosomes remaniés ou surnuméraires pourrait interrompre l’appariement et la disjonction des chromosomes homologues.

En conclusion il est possible qu’un effet inter- chromosomique soit provoqué par certaines anomalies constitutionnelles. Cette éventualité est toutefois exceptionnelle.

D- Origine des aberrations structurales

Il est probable que des fragments acentriques préexistants sont éliminés au cours de la méiose I. De nouveaux fragments chromosomiques apparaissent ultérieurement. Ils peuvent être observés au cours de la méiose II. Laurie et al., (1985) ont pour leur part rapporté sur 200 cas étudiés à ce stade un taux de cassures évalué à 5.5%.

Les cassures chromosomiques qui ont été  mises en évidence semblent être en relation avec des altérations de l’ADN au cours de la spermiogenèse. L’ADN des spermatozoïdes humains matures comporte de nombreux sites sensibles (Shing et al., 1989). Ces derniers pourraient être le siège de cassures pendant la première division du système homme-hamster. D’autre part la rapidité du transit à travers l’épididyme humain pourrait induire une instabilité de l’ADN des spermatozoïdes matures.

C’est au cours du transit épididymaire que se forment la plupart des ponts disulfures permettant la stabilisation du complexe ADN-protamine du noyau du spermatozoïde (Balhaurin, 1982). Il a été démontré  que 15 à 20% des spermatozoïdes humains contiennent une chromatine incomplètement condensée. L’ADN du sperme humain injecté dans un œuf de hamster se décondense plus vite que celui d’autres espèces.

D – 1 : Réplication de l’ADN dans les spermatozoïdes

Une étude cinétique de la réplication de l’ADN dans le système homme hamster a été réalisée par Brandriff et Gordon (1989). Ces auteurs ont démontré que la réplication débute 3 heures et demi après l’insémination. après 4 heures 30,  la duplication de l’ADN a débuté dans 50% des pronuclei mâles. Après 6 heures, elle est réalisée à 80%. Elle n’est toutefois jamais complète en raison de phénomènes de polyspermie et de fécondation tardive.

 Les œufs, programmés pour transformer seulement un spermatozoïde, parviennent toutefois à métaboliser une quantité très importante de nucléotides supplémentaires. Les enzymes et les autres macromolécules requis pour la réplication sont également utilisés. Les spermatozoïdes surnuméraires ne sont pas en mesure de répondre aux signaux cytoplasmiques de réplication.

Si on se réfère à la taille des noyaux, on constate que 100% des pronuclei complètement développés ont une réplication optimale. 70% des pronuclei de petite taille sont également impliqués dans la synthèse d’ADN, ce qui indique la présence d’une adéquation taille du noyau – synthèse de l’ADN.

Dans l’œuf de souris, la synthèse d’ADN a lieu seulement après l’individualisation du pronucleus (Sophitikis et al 2001). Le spermatozoïde de hamster injecté a le même comportement que le gamète mâle humain.

D-2 : Action des constituants de l’œuf sur les chromosomes

On sait que certaines lésions des spermatozoïdes existant avant la fécondation disparaissent après la fusion des pronuclei. Une synthèse complémentaire d’ADN a lieu dans les spermatozoïdes irradiés par les UV (Pedersen et al, 1992). Chez la souris certaines lésions  de l’ADN sont réparées lors de la première division de segmentation.

En cas de fusion d’un spermatozoïde humain irradié avec un œuf de hamster les aberrations chromosomiques ont pour la plupart disparu quelque soit leur type lorsqu’a lieu la première division de segmentation (Steuerwald et al 2001). La capacité de réparation est toutefois moindre chez le hamster que chez la souris.

Il est possible que le système sperme humain-œuf d’ hamster opère comme un  "système expression" pour des lésions chromosomiques par ailleurs non identifiables. Il y a ici une analogie avec la problématique des sites fragiles dont l’expression nécessite un environnement spécifique (milieu de culture par exemple) (Ecozcue et al 2000). Le mécanisme de réparation de l’ADN dans l’œuf reste inconnu.

D-3 : Aberrations structurales survenant de novo

Les anomalies structurales post-méiotiques des chromosomes humains ont sans doute une incidence clinique limitée car elles entraînent dans la plus part des cas une interruption très précoce de la grossesse, ceci en raison de l’importance du déséquilibre génomique. Toutefois, il est possible que des grossesses comportant ce type d’aberrations parviennent à terme.

      Un cas de délétion interstitielle du 15 d’origine paternelle a été décrit par Bulter et

al., (1986). Dans la série de Magenis et al (1983), 33 aberrations structurales sur 41 étaient d’origine paternelle. Certains sujets sont sans doute prédisposés aux réarrangements structuraux au cours de spermatogenèse. Des erreurs de réplication de l’ADN peuvent intervenir et être favorisées par l’exposition à des agents mutagènes.

D-4 : Effets de l’âge sur la fréquence des anomalies chromosomiques

Il a été suggéré que l’âge paternel a une incidence sur la fréquence des trisomies. Toutefois les résultats des diagnostics prénataux et des études néonatales sont contradictoires (Hassold et al 2002).

Martin et Rademarker (1987) ont étudiés les compléments chromosomiques provenant de 30 hommes normalement fertiles et répartis en six groupes d’âge (20-24, 25-29, 30-34, 35-39, 40-44, 45-+) afin d’évaluer l’incidence de l’âge paternel.

Un minimum de 30 compléments a été analysé chez chaque sujet. L’étude a été effectuée «  à l’aveugle », sans que l’expérimentateur connaisse l’âge du donneur. Une relation significative entre l’âge du sujet et le taux hyper haploïdie a été démontrée. Un taux de 3,7% d’hyperhaploïdies chez les sujets plus jeunes a été noté .L’ hyper haploïdie est par contre réduite chez les sujets les plus âgés.

Des résultats comparables ont été obtenus par Pellestor et al (1994). Ces auteurs ont notamment étudié des cas de trisomie 21 d’origine paternelle. D’après les conclusions de ce travail, la fréquence du syndrome de Down pourrait décroître quand l’âge paternel augmente. Carotters et Philippi (1988) ont également démontré que la fréquence du syndrome de klinefelter diminue de manière significative avec l’âge paternel.

La fréquence des anomalies structurales augmente d’autre part avec l’âge et peut atteindre 13,6% après 44 ans. Tomar et al., (1984) ont précisé que plus de 80% des aberrations structurales « de novo » sont d’origine paternelle l’accroissement du nombre des anomalies structurales avec l’âge pourrait être en relation avec l’activité divisionnelle qui caractérise la spermatogenèse ou avec l’exposition à des agents mutagènes.

En résumé les données de la littérature ne démontrent pas un accroissement significatif des trisomies avec l’âge paternel. La fréquence des compléments hyper haploïdes diminue avec l’âge. Celle des anomalies structurales augmente par contre dans les mêmes conditions (relloh et al 2003).

D-5 : Effets de la congélation sur la fréquence des anomalies chromosomiques du sperme

Une étude concerne les effets de la congélation sur la fréquence et sur le type des anomalies chromosomiques du sperme humain. L’insémination thérapeutique avec donneur (ITD) utilise du sperme décongelé. Elle relève de la pratique courante. Peu d’études sont actuellement disponibles sur les conséquences chromosomiques de la congélation et de la décongélation du sperme.

 Il a été montré que la congélation permet l’élimination de spermatozoïdes défectueux. Le taux d’avortement spontanés serait réduit en cas d’ITD. D’autres études révèlent par contre un accroissement des naissances trisomiques après ITD .

Les types d’anomalies sont identiques dans les deux séries à l’exception de l’hypohaploïdie que la congélation semble accroître. Il convient de préciser que ce dernier résultat constitue un artefact technique dû à la méthode de fixation utilisée. 52,1% des spermatozoïdes sont porteurs d’un X dans le sperme frais, 53,5% dans le sperme décongelé. Il n’y a donc pas de variation significative du sexe ratio.

Il semble que la congélation n’a aucune incidence sur la survenue des anomalies chromosomiques du spermatozoïde. Elle ne modifie pas le sexe ratio. Cette constatation pourrait confronter la pratique de l’ITD. La congélation est d’autre part un moyen efficace de conservation de prélèvements devant faire l’objet d’analyses relevant du domaine de la recherche.

 D-6 : Sélection du sperme

Un point important concernant l’utilité du système homme-hamster dans l’analyse de la ségrégation méiotique est l’éventualité d’une sélection des spermatozoïdes par ce modèle expérimental. Des études sur la souris et le hamster démontrent que la nature du complément chromosomique du spermatozoïde n’influence pas son pouvoir fécondant (Echinlaub 2002).

La présence d’aneuploïdie dans tous les groupes de chromosomes quelque soit leur taille est un argument contre la sélection.

La présence d’un sperme chromosomiquement anormal ne rend pas impossible la fécondation des œufs d’hamster. Martin et al., (2002) ont démontré que chez 30 donneurs sélectionnés en raison d’une mobilité élevée de leur spermatozoïdes (technique du «  swim-up »), il n’existe de différence ni dans la fréquence des anomalies chromosomiques ni dans la morphologie des gamètes. Ces études, bien qu’indirectes, pourraient confirmer l’hypothèse suivant laquelle la sélection des spermatozoïdes s’effectue indépendamment d’éventuelles anomalies chromosomiques.

D- 7 : Hybridation in situ(HIS)

L’étude des anomalies chromosomiques numériques et structurales est une des applications les plus importantes de l’HIS. Les aneuploïdies ainsi que les translocations et les délétions sont les anomalies les plus fréquemment observées (PINKEL et al., 1988). Une telle étude permet de préciser l’existence et l’origine d’aberrations chromosomiques détectées par diagnostic cytogénétique chez des patients présentant des anomalies phénotypiques. Par exemple, l’origine des iso chromosomes et des chromosomes en anneau a ainsi pu être déterminée (Kallomeini et al 2000).

L’étude cytogénétique des gamètes humains a été réalisée par les techniques d’hybridation in situ pour évaluer l’aneuploïdie et le sexe ratio (Martin et al 2003, Munne et al 2003). ces techniques sont délicates à mettre en œuvre pour l’étude du gamète. En effet, le spermatozoïde est une cellule hautement différenciée ou les chromosomes ne sont détectables qu’après fécondation.

Deux protocoles sont possibles. Le premier consiste à appliquer l’HIS directement sur

les spermatozoïdes après choc photonique.

  Dans ce cas le résultat est obtenu sur noyau interphasique. L’autre méthode utilisée est la fécondation in vitro hétéro spécifique homme-hamster après laquelle les chromosomes du spermatozoïde humain peuvent être étudiés en métaphase.

Les ovocytes sur lesquels l’HIS est appliquée sont des ovocytes qui proviennent d’échecs de fécondation in vitro (F.I.V). Ils sont soit immatures (bloquées au stade diacinèse, métaphase I), soit matures (bloquées en métaphase II).Ainsi la vérification de la fiabilité des méthodes expérimentales de tri des spermatozoïdes peut être réalisée par marquage du chromosome X ou Y. cette technique sert aussi à la vérification du stock chromosomique des gamètes chez des parents présentant des translocations équilibrées ou des anomalies chromosomiques liées au sexe.

Sur des zygotes  ou des embryons non congelables et non transférables, un diagnostic du sexe sur blastomère après traitement à la pronase est également possible (Benkhalifa et al 2003).

Le diagnostic du sexe avec une sonde Y, après biopsie de blastomère et avant transfert embryonnaire a été réalisé par Handyside et al., 1990. L’HIS a été utilisée pour le diagnostic génétique pré-implantatoire sur des embryons de deux jours (Gianorelli et al 2003).

Grâce aux techniques de cytogénétique moléculaire on peut ainsi identifier les embryons mâles en cas de présence d’un gène défectueux lié au chromosome X de la mère (hémophilie, etc..). lors du sexage des embryons, les anomalies numériques des chromosomes sexuels sont également décelées. La mise en évidence d’une polyploïdie du chromosome Y sur des  cellules  prélevées sur un embryon issu de FIV permet d’éviter de réimplanter l’embryon atteint.

La recherche des anomalies chromosomiques chez le fœtus est pratique principalement dans les grossesses à risque : femmes âgées de plus de 38 ans, présence d’une anomalie de structure chez l’un des parents, couple ayant déjà eu un enfant atteint d’aberration chromosomique, ou présence d’un signe d’appel échographique. L’HIS peut être appliquée sur des cellules amniotiques non cultivées, des lymphocytes du sang fœtal ou les villosités choriales. Elle permet un diagnostic rapide des aberrations chromosomiques fœtales les plus fréquentes.

L’utilisation d’une sonde constituée de séquences répétitives de la région centromérique du chromosome 18 a également rendu possible la détection des trisomies 18 sur des cellules amniotiques (Coonen et al 1999).

Les anomalies structurales sont également détectables par F.I.S.H. la CISS-hybridation de deux chromosomes est utilisée pour mettre en évidence les points de cassure dans les translocations équilibrées. (Munne et al 2000). L’origine parentale des translocations peut être précisée par cette technique.

La cartographie par F.I.S.H. est d’une grande importance pour la localisation et le séquençage des gènes. Elle permet d’affiner ou de compléter les données obtenues en cytogénétique classique. La cartographie peut être étendue à un chromosome métaphasique entier par l’utilisation d’une banque de sondes clonées dans des cosmides (painting). Ce type de cartographie en confirme des résultats obtenus par les tests de linkage (LICHTER et al., 1990a).

Les mécanismes de l’évolution chromosomique au cours de la spéciation tels que les translocations et les fusions centriques sont confirmés par F.I.S.H. Ainsi la présence de séquences communes entre les chromosomes X et Y a permis à JAUCH et al., (1990) d’établir une hypothèse concernant l’évolution des chromosomes sexuels .L’ensemble de ces résultats confirme l’utilité de l’application des techniques de F.I.S.H. dans le domaine de la reproduction humaine.          

     

IV - ANOMALIES DE L’OVOCYTE HUMAIN

A - Evaluation cytogénétique du degré de maturité de l’ovocyte

  L’analyse cytogénétique permet un contrôle direct de la maturité nucléaire. Dans le protocole de F.I.V humain, l’appréciation de la maturité des ovocytes est basée sur l’observation microscopique du complexe cumulo-ovocytaire (Veeck et coll. 1983) et donne lieu à une classification codifiée des ovocytes recueillis (Plachot et al 2000). La présence du premier globule polaire est le seul critère cytologique direct du degré de maturité nucléaire.

L’étude cytogénétique est, quant à elle, basée sur l’observation et l’identification de métaphases de première et deuxième division méiotique permet une détermination précise du degré de maturité nucléaire de l’ovocyte. Pour ce fait, l’aspect morphologique des chromosomes (ou chromatides) est un facteur essentiel qui s’appuie sur des données ultrastructurales précises. Ainsi, au stade de la métaphase II, les chromosomes présentent un aspect particulier très étalé  dû à l’amorce de la séparation des chromatides sœurs (méta-anaphase) (Sathanathan 1985).

L’observation de 2 lots haploïdes dans le cytoplasme de 2 ovocytes cytologiquement considérés comme immatures peut s’expliquer par la non-expulsion du premier globule polaire. Ce type d’observation a également été rapporté par Plachot (2000),

La formation et l’expulsion du premier globule polaire est un processus cytologique dans lequel les éléments du cytosquelette jouent un rôle essentiel ( Lopata et coll. 1980). L’utilisation de drogues spécifiques telles que le nocodazole et la cytochalasine D sur des ovocytes de souris a montré que l’extrusion du globule polaire nécessite un réseau de microfilaments fonctionnels, et que les chromosomes sont capables de modifier l’organisation du cytosquelette dans leur environnement, ceci afin de permettre la division inégale qui donne lieu à l’expulsion du globule polaire (Verlinsky et al , 1998, 2001).

Une déficience de ce mécanisme intracellulaire pourrait être responsable de la non-expulsion du premier globule polaire et de l’arrêt de la maturation nucléaire.

Une autre alternative compatible avec l’observation de 2 lots chromosomiques, consiste en la fécondation d’un ovocyte bloqué en métaphase II par un spermatozoïde qui subit une activation sous l’action de facteurs de décondensation ovocytaire  (Thibault et Gétard 1970) mais celle-ci s’opère sans phase S préalable, d’où l’observation de chromatides simples à l’intérieur de l’œuf. Cependant, ce phénomène dont la fréquence a été estimé à 3 ou 4% dans le cadre de la fécondation in vitro.

Il faut souligner que l’identification des chromosomes d’ovocytes est beaucoup plus difficile que celle des chromosomes  mitotiques ou de spermatozoïdes. La forte condensation des chromosomes d’ovocytes ne permet pas d’obtenir un marquage très précis. Cependant, l’utilisation systématique d’une technique de dénaturation telle que les bandes R ou G, facilite dans la plupart des cas la réalisation du caryotype.

B-  Incidence de l’aneuploïdie dans l’ovocyte humain

L’hypo haploïdie représente l’anomalie la plus fréquente. L’excès d’hypohaploïdie est une donnée rapportée dans toutes les études cytogénétiques des ovocytes (Pellestor et al 2003, Benkhalifa et al 2003) et d’espèces animales (Mikamo et Kamiguchi 1983). Il est généralement attribué à une perte artéfactuelle des chromosomes. Il est donc possible de retenir les hypohaploïdies comme des anomalies vraies, bien qu’elles ne soient pas observées chez les sujets vivants. Kuliev (2003) a émis l’hypothèse que le mécanisme d’expulsion du globule polaire pourrait favoriser la perte chromosomique lors de l’analyse.

La majeure partie des informations concernant la méiose féminine est issue d’enquêtes épidémiologiques. Des études aussi diversifiées que celles portant sur les trisomies dans les avortements spontanés , les nouveaux nés porteurs de trisomies  ou encore les porteurs de translocations robertsoniennes de novo ont montré que la majorité des anomalies chromosomiques sont d’origine maternelle et résultent de non-disjonctions de première division méiotique. D’où l’idée préconçue de trouver une fréquence élevée d’aneuploïdies dans les gamètes femelles bien que la fréquence globale d’aneuploïdies puisse être sous estimée, puisque l’étude des ovocytes II ne permet pas de comptabiliser les éventuelles non-disjonctions de deuxième division méiotique.

Différentes études ont montré que le taux d’aneuploïdies est de 20-25%. Ce résultat est en accord avec l’hypothèse d’un taux élevé de non-disjonction dans le sexe féminin. En effet, les estimations de la fréquence d’aneuploïdies dans l’ovocyte humain varie de 15-55 %  en fonction des travaux et des séries (kuliev et al 2003). En moyenne, cette valeur est élevée en comparaison avec les taux observés dans les autres espèces mammifères (de 1-10 %) (Bond et Chandley 1983) ou encore dans le spermatozoïde humain (10-15 %).

La plupart des anomalies rapportées dans la littérature sont létales (disomies doubles ou triples ; nullosomies simples et multiples) et ne sont généralement pas retrouvées dans les produits d’avortements spontanés. Mais les études réalisées sur les embryons humains pré-implantatoire et les ovocytes multipronuclées (Plachot et al 2001) ont montré que des conceptus monosomiques, voire haploïdes pouvaient présenter un développement embryonnaire similaire à celui des embryons chromosomiquement normaux.

            Toutefois, on peut se poser la question de savoir si les données in vivo sont représentatives du mécanisme de non disjonction in vitro .Tout d’abord, les ovocytes analysés sont issus de techniques de PMA, c’est à dire recueillis chez des femmes ayant subi un traitement hormonal de super ovulation. Or, ces hormones ont été suspectées, d’augmenter le taux d’anomalies chromosomiques.

Les expérimentations animales indiquent seulement en cas de traitement par les gonadotrophines, une augmentation des embryons polyploïdes (Fujimoto et coll. 1974). Généralement, cette polyploïdie est due à une polyspermie et par conséquent liée à une défaillance de la réaction corticale ovocytaire. Chez la souris. L’induction hormonale peut conduire à des anomalies structurales (Elbling et Colet 1985) mais l’effet sur les non-disjonctions  chromosomiques est encore discuté .Hansmann et Probech (1979) n’ont observé aucune  influence du traitement hormonal de superovulation sur le processus de non-disjonction chez la femelle hamster.

Outre la question de l’induction hormonale, on peut suspecter le vieillissement  de l’ovocyte au cours de la culture in vitro d’être responsable d’une surestimation du taux d’anomalies chromosomiques. Le délai entre le moment de la ponction folliculaire et l’analyse cytogénétique ne doit pas excèder  72 heures. Ortiz et al (1982) ont vérifié que la majorité des ovocytes recueillis sont encore intact in vitro 72 heures après l’ovulation. Le fuseau de division des ovocytes humains non fécondés reste stable en milieu de culture durant 2 à 3 jours (Edwards et coll. 1981), aussi des modifications spontanées de sa structure ne peuvent être à l’origine d’aneuploïdies.

Des études de la synthèse protéique dans les ovocytes humains non fécondés in vitro souligne que la composition protéique reste inchangée pour des temps de culture allant de 12 heures à 52 heures (confirmant ainsi l’intégralité métabolique des ovocytes maintenus en culture). L’analyse des pré-divisions équilibrées des bivalents dans le premier globule polaire a montré un pourcentage de 6% dans les globules polaires frais contre 35% dans les oeufs analysés après une lecture in vitro  de 24-48 heures(Munne et al.1995).

Le recrutement  massif des follicules après stimulation ovarienne a été mis en cause en tant que générateur de non disjonctions ovocytaires. Cette  donnée mérite d’être vérifiée, mais d’ores et déjà, elle renforce l’idée que devant  la multiplicité et la diversité des paramètres des  techniques d’AMP, on ne peut nullement  affirmer  que ces manipulations présentent une totale innocuité vis à vis  du patrimoine génétique de l’ovocytes.   

 C- Effet de l’âge maternel L’effet de l’âge maternel sur la fécondité et la survenue d’anomalies chromosomiques est un problème complexe. Il est clairement établi qu’à la naissance les trisomies sont plus fréquentes chez les femmes âgées. La fréquence des avortements spontanés est aussi directement corrélée avec l’âge maternel (Pellestor et al 2003) ont mis en évidence une corrélation positive très nette après 35 ans, entre le vieillissement maternel et la fréquence des trisomies dans les produits d’avortements spontanés. Toutefois, des exceptions existent qui concernent les doubles trisomies, les trisomies 2 et 5 dont l’incidence ne varie pas avec l’âge, et la trisomie 4 dont la fréquence décroît.

L’effet de l’âge maternel apparaît donc inversement proportionnel à la taille des chromosomes surnuméraires (Hassold et al 2003), mais la prédominance de certaines trisomies comme la trisomie 16 dans les avortements spontanés, indique que la formation de ces aberrations fait intervenir d’autres facteurs indépendants de l’âge

Etant donné que la majeure partie des trisomies autosomiques à pour origine une non-disjonction de première division méiotique, il a été recherché une étiologie pouvant rendre compte du rapport existant entre l’âge maternel et l’aneuploïdie

Une première hypothèse suggère que les chromosomes peuvent se séparer (désynapsis) au cours de la phase diplotène de la première division méiotique. Ce phénomène serait d’autant plus probable que la durée de la phase diplotène est longue ; d’ou une augmentation logique de la fréquence des non-disjonctions chez les femmes âgées. Des facteurs environnementaux, géographiques, voire saisonniers pourraient favoriser ce mécanisme (Jongbloct et Vrieze 1985).

D’autres auteurs ont vu dans cette dépendance des trisomies à l’âge maternel la conséquence d’un épiphénomène de vieillissement du système de reproduction dans son ensemble, En particulier l’allongement des cycles sexuels chez le rat a été associé à une augmentation des embryons morphologiquement anormaux, mais il n’existe pas de données concernant directement la ségrégation méiotique.

L’hypothèse la plus crédible est représentée par la théorie « de la ligne de production » proposée par Henderson et Edwards en 1968. D’après ce modèle, la probabilité d’asynapsis des chromosomes homologues est d’autant plus élevée que les ovocytes sont formés tardivement dans l’ovaire fœtal. La reprise de la croissance folliculaire durant la vie adulte s’effectuerait dans le même ordre que la formation embryonnaire des follicules, et ainsi les ovocytes anormaux  seraient produits en plus grand nombre à l’approche de la ménopause. Cette hypothèse est fondée sur l’observation, dans les ovocytes de souris âgées, d’une diminution de la fréquence des chiasmas et d’une augmentation du nombre des univalents. Ce phénomène a été confirmé par d’autres travaux, mais certaines expérimentations indiquent que les chromosomes formant les univalents ne sont pas systématiquement ceux impliqués dans les trisomies.

            Ces résultats sont donc à priori en désaccord avec l’existence d’une corrélation entre l’âge maternel et les non-disjonctions méiotiques. Par contre, ils fournissent un argument en faveur de l’hypothèse selon laquelle le rapport observé entre le vieillissement maternel et l’aneuploïdie est la conséquence d’une diminution de l’efficacité des mécanismes de sélection in utéro vis à vis des conceptus anormaux. Cette notion qui s’appuie sur des travaux tenant compte de l’origine parentale des trisomies 21. Aucune différence significative de l’âge maternel n’a été observée, que la non-disjonction soit d’origine paternelle ou maternelle (Mattei et coll. 1980).

L’analyse des  résultats concernant les ovocytes doit être interprété avec prudence car le risque d’un biais statistique ne peut être écarté compte tenu du petit nombre d’aneuploïdie recensées par classe d’âge et de leur caractère hétérogène. A cet égard, il serait intéressant d’étudier la distribution par classes d’âge des ovocytes uniquement aneuploïdes pour les chromosomes dont le taux de non-disjonctions est fortement corrélé à l’âge, en particulier des ovocytes présentant une disomie 21. Cette étude demande à être poursuivie sur un échantillon plus vaste d’ovocytes provenant de femmes d’âges plus élevés.

Récemment l’équipe de A Kuliev a utilisé une technique dérivée du DPI que l’on pourrait qualifier de « pré-fécondatoire » chez des femmes âgées en moyenne de 38.5 ans qui bénéficiaient d’une FIV pour stérilité. 8382 ovocytes ont été testés avant fécondation par la méthode FISH. Des résultats interprétables ont été obtenus dans 6733 cas avec un taux d’anomalies chromosomique de 52.1%, ne laissant que 47.9% d’ovocytes  « normaux » disponibles pour la FIV. Les anomalies de ces ovocytes provenaient dans 42% des cas d’erreurs lors de la phase I de la méiose, dans 31% des cas lors de la phase II et dans 27% des observations au cours des deux phases.

Sur les ovocytes euploïdes détectés, 2587 ont été fécondés et transférés au cours de 1100 cycles de traitement aboutissant à 241 grossesses et à la naissance de 176 enfants en bonne santé.

Pour les auteurs ce dépistage « pré-fécondatoire » des anomalies chromosomiques devraient  permettre d’améliorer les résultats de la FIV chez les mères de plus de 38 ans tout en diminuant le risque de porter un fœtus souffrant d’une anomalie chromosomique et donc le nombre d’avortements thérapeutiques.

F- Zygotes et embryons bloqués

            1* les zygotes bloqués

L’étude de 155 zygotes bloqués a montré 47 cas présentant des lots de chromosomes haploïdes condensés en simples chromatides, 56 avec une asynchronie de décondensation nucléaire et de l’ADN pulvérisé   et 52 arrêtés à des différents stades de la première division somatique  dont le tiers avec des anomalies chromosomiques ( Benkhalifa et Munne 1999) 

A partir de ces données et de celles décrites ultérieurement ( Benkhalifa et al. 1996), il paraît clair que les anomalies  cytogénétiques peuvent contribuer à la formation d’un embryon anormal à cause d’une parthénogenèse, d’une immaturité cytoplasmique, de divisions asynchrones ou de non disjonction après fécondation conduisant à un échec de développement embryonnaire.

Analyse des zygotes bloqués

Nombre de zygotes (155)

Aspect de l’ADN

47

Complément chromosomique haploide  condensé en chromatide

(sans  syngamie)

56

Asynchronie  nucléaire et ADN pulvérisé

52

Arrêté à différents stades de la première division somatique

2* Les embryons (bloqués, avec un retard de segmentation ou fragmentés et normaux)

Une étude réalisée par Benkhalifa et Munne  (1999), sur un  total, 3 629 blastomères, biopsiés le 4ème  jour du développement , sont obtenus à partir de 524 embryons monospermiques. Parmi ces blastomères , 2796 ont été étudiés par FISH alors que les autres sont, soit perdus après la biopsie, soit n’ont pas de noyaux ou n’ont pas été détectés par cette technique. Pour 1504 blastomères,  une analyse avec les sondes des chromosomes  X, Y , 18 et 13/21 a été effectuée ; les sondes X, Y et 18 ont été étudiées pour les autres blastomères .

Les tableaux I, II et III résument les résultats obtenus suite à l’analyse de 182 embryons bloqués, 154 embryons avec un retard de segmentation ou fragmentés et 188 embryons normaux. En plus des embryons haploïdes, diploïdes et bloqués, les embryons avec un retard de segmentation et les normaux, présentent des taux différents de mosaïcisme diploïde extensif (39.6 %, 25.2% et 14.1 % respectivement ). Ces résultats montrent d’une part que le taux de mosaïcisme diploïde augmente considérablement  avec le dysmorphisme d’autre part, la polyploidie ainsi que le nombre de blastomères multinuclés  sont les principales anomalies chromosomiques rencontrées chez les embryons bloqués. Dans cette étude on a pu étudier le rôle important de l’aneuploïdie des gonosomes, des chromosomes 13, 18 et 21 comme anomalie chromosomique durant le développement de l’embryon.

Tableau I : Anomalies détectées sur les embryons bloqués

Embryons analysés avec les sondes X, Y, 18 et 13/21

91

Embryons analysés avec les sondes X, Y 18

91

Les anomalies chromosomiques

Monosomie YO et mosaïcisme (66% multinuclées)

1

Monosomie YO et polylpoidie (YY4(18)8(13/21))

1

Monosomie XO et mosaïcisme diploïde (80%)

1

Monosomie 18

2

Monosomie 18 et mosaïcisme diploïde (60%)

1

Monosomie 18 et polyploidie  (2X2Y3(18)8(13/21))

1

Trisomie 18 et mosaïcisme (50% multinuclé)

1

Trisomie 18 et polyploidie (4X6(18)8(13/21))

1

Trisomie 13/21

1

Monosomie 13/21 et monosomie 18

1

Monosomie diploïde limitée

12

Monosomie diploïde extensive

34

Polyploidie avec la même ploidie dans toutes les cellules

39

Mosaïcisme polyploide

39

Mosaïcisme haploide

5

Embryons normaux

42

Nombre total analysé

182

Aneuploidie total pour X , Y et 18

9

Aneuploïdie total pour 13/21

2

Mosaïcisme diploïde totale

50

Polyploïdie totale

81

Haploïdie totale

5

Tableau II : Anomalies détectées au niveau des embryons avec un retard de segmentation et /ou fragmentés  

Embryons analysés avec les sondes X,Y,18 et 13/21

89

Embryons analysés avec les sondes X,Y,18

65

Les anomalies chromosomiques

Monosomie XO , Monosomie 18 et mosaicisme (50% multinuclée)

1

Monosomie YO et Mosaicisme dilpoide (66% anormaux)

1

Monosomie 18

1

Monosomie 18 et mosaicisme diploïde (57%)

1

Monosomie 18 et mosaicisme polyploide (20%)

1

Trisomie 18

4

Monosomie 13/21

6

Double monosomie 13/21

1

Double monosomie 13/21 et mosaicisme (100% anormaux)

1

Double monosomie 13/21 et mosaicisme diploïde (13% anormaux)

1

Trisomie 13/21

1

Monosomie diploïde limitée

38

Monosomie diploïde extensive

29

Polyploidie avec le même ploidie dans toutes les cellules

4

Mosaicisme polyploide

16

Mosaicisme haploide

3

Embryons normaux

45

Nombre total analysé

154

Aneuploidie totale pour X, Y et 18

9

Aneuploïdie totale pour 13/21

10

Mosaïcisme diploïde totale

73

Polyploïdie totale

20

Haploïdie totale

3

Tableau III : Anomalies détectées  chez les embryons normaux

    Embryons analysés avec les sondes X,Y,18 et 13/21

103

Embryons analysés avec les sondes X,Y, 18

85

Les anomalies chromosomiques

Monosomie XO

3

Trisomie XXY

1

Monosomie 18

3

Trisomie 18

2

Monosomie 13/21

5

Monosomie 13/21 et mosaicisme (33% anormaux)

1

Monosomie 13/21 et trisomie 18

1

Monosomie 13/21 et monosomie 18

1

Trisomie 13/21

2

Trisomie 13/21 et trisomie 18

1

Trisomie 13/21 et monosomie  XO

1

Trisomie 13/21 et monosomie YO

1

Trisomie 13/21 et trisomie XXX

1

Trisomie 13/21 et mosaicisme (26 à 37% anormaux)

2

Trisomie 13/21 et mosaicisme (37 à60% anormaux)

3

Mosaicisme diploïde limitée

46

Mosaicisme diploïde extensive

22

Polyploïdie avec le même ploïdie dans toutes les cellules

1

Mosaicisme polyploïde

3

Mosaicisme haploïde

7

Embryons normaux

80

Nombre total analysé

188

Aneuploïdie totale pour X, Y et 18

10

Aneuploïdie totale pour 13/21

19

Mosaicisme diploïde totale

75

Polyploïdie totale

4

Haploïdie totale

7

3*Morula et blastocytes

L’analyse de 54 embryons tardifs (13 morula et 41 blastocytes) ont été étudiés par FISH en utilisant des sondes centromériques spécifiques des chromosomes X (14 embryons ) , Y (13 embryons) et 18 (27 embryons). On parle de polyploïdie lorsqu’on observe plus de 3 spots pour les chromosomes 18 et X et plus de 2 spots pour le chromosome Y . Les résultats de FISH obtenus sur les cellules lymphocytaires fœtales trisomiques 18 ont été utilisées comme contrôle interne. Les résultats de FISH ont été comparés à l’étude cytogénétique classique (Benkhalifa et al 1999).

Les résultats de FISH obtenus sur les 54 embryons sont résumés dans le tableau I. Parmi les 27 embryons analysés par la sonde spécifique du chromosome 18, huit (29.6%) présentaient des noyaux avec plus de 2 signaux d’hybridation parmi lesquels 2 embryons présentaient des noyaux avec 4 spots (mosaïcisme 2n/4n), 1 embryon avec 8 spots (mosaïcisme 2n/8n), 2 embryons avec 5 spots (mosaïcisme 2n/5n) et 2 avec 7spots (mosaïcisme 2n/7n).

L’application de la FISH sur des embryons de sexe inconnu avec uniquement une sonde spécifique du chromosome X ne permettait pas de connaître la nature de la polyploïdie. En effet, le degré de la polyploidie varie de 2n/6n à 2n/10n dans le cas où l’embryon est mâle et de 2n/3n à 2n/5n chez l’embryon femelle. En somme, parmi les 14 embryons étudiés, 5 étaient mixoploïdes (35.7 %). L’extension de la polyploïdie chez les mâles a été étudiée par une sonde spécifique du chromosome Y. Trois embryons sur 13 étaient mixoploïdes ( 23.1%) dont 1 présente un mosaïcisme 2n/4n, l’autre 2n/6n et le dernier 2n/8n.

L’étendue de la mixoploïdie dans les morula ainsi que les blastocystes est représentée dans le tableau I. Le rapport de la mixoploïdie totale était de 16/54 (29.6%). Indépendamment des sondes utilisées, aucune différence statistique n’a été observée dans la proportion des cellules mixoploïdes, des morula (30.8%) et des blastocystes (29.3%) (tableau II)

Tableau I : Nombre des signaux d’hybridation dans les noyaux des morulas et des blastocystes

Sonde ADN

Nombre d’embryons analysés

Nombre total d’embryons mixoploïdes (%)

18

27

8 (29.6)

X

14

5(35.7)

13

13

3 (23.1)

Tableau II : Incidence et pourcentage de mixoploïdes dans la morula ( n=13) et les blastocystes (n=41)

Sonde ADN spécifique du chromosome

Incidence en ( %)

18         X              Y

Morula

2/7        ¼            2/2

(28.6)   (25.5)    (50.0)

4 /13

(30.8)

Blastocystes

6/20       4/10           2/11

(30.0)     (40.0)      (8.2)

12/41

(29.3)

30% des morulas et blastocystes humains semblent être mixoploïdes, ce qui suggère que ces cellules polyploïdes ne doivent pas être considérées comme anomalie ; mais plutôt en tant qu’une partie du processus normal du développement. Chez l’homme, la mixoploïdie semble apparaître  au stade de morula, probablement de manière plus précoce et l’étendue de la ployploïdie peut être élevé jusqu'à 10n, ce qui démontre que les résultats obtenus sur une seule cellule ne sont pas nécessairement représentatifs de l’embryon.

VII- CONCLUSION

La cytogénétique du sperme de sujets sains s’est révélée être une voie d’investigation riche en enseignements

Son intérêt scientifique est évident, le spermatozoïde étant l’ultime cellule de la spermatogenèse, et de ce fait, le vecteur de la  plupart des anomalies chromosomiques.

L’estimation du taux d’anomalies chromosomiques dans le sperme constitue donc une données essentielle, et les résultats obtenus amènent des éléments de réponse ou de vérification à diverses interrogations et hypothèses telles que l’équivalence des non disjonctions, l’existence d’une fécondabilité sélective des spermatozoïdes ou encore la contribution masculine à la constitution de certaines anomalies.

 Il apparaît que certains aspects du problème des anomalies chromosomiques des gamètes mâles n’ont pas été abordés, en particulier les facteurs étiologiques de ces aberrations. Parmi tous les facteurs envisageables, l’un des plus important est le facteur « temps ».

L’effet de l’âge paternel à essentiellement été analysé pour la trisomie 21.Selon les enquêtes. Il est estimé nul (Benkhalifa 2003) ou significatif (Plachot 2000).L’étude cytogénétique du sperme doit permettre une approche plus précise et étendue à toutes les anomalies, à condition de disposer d’un nombre suffisant de spermes pour chaque tranche d’âge significative. La mise en œuvre de ce travail se heurte au problème du recrutement des donneurs de sperme âgés (> à 50 ans). La deuxième alternative qui porte sur le vieillissement des spermatozoïdes, est plus facilement réalisable ; L’éventualité d’une relation entre la rétention prolongée des spermatozoïdes dans l’épididyme après leur formation et l’augmentation des anomalies chromosomiques a été envisagée à la suite d’enquêtes épidémiologiques. Chez la souris, le vieillissement in situ des spermatozoïdes est effectivement corrélé à une augmentation significative de la fréquence des anomalies chromosomiques des zygotes.

En relation avec cette revue de la littérature, il est claire que des anomalies chromosomiques pré et post zygotique peuvent jouer un rôle important dans le procecus de développement embryonnaire et ainsi dans les echecs de tentative d’aide médicale a la procréation. Il est certain qu’un travail de recherche important reste a réaliser afin de comprendre les interactions entre des facteurs géniques et epigeniques dans les echecs de L’AMP.